ABSTRACT
La identificación de la fuente de alimentación de insectos hematófagos puede proporcionar información sobre la capacidad vectorial, patrones de alimentación en condiciones naturales y proveer indirectamente datos sobre probables reservorios de enfermedades. Varias técnicas de identificación son empleadas, entre ellas las más utilizadas son las basadas en reacciones antígeno-anticuerpo. Actualmente, se han desarrollado ensayos moleculares, algunos de ellos permiten detectar e identificar solo sangre humana. Otros como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen mitocondrial citocromo b (cyt b), que ha mostrado alto grado de sensibilidad y especificidad, permite detectar e identificar otras especies de vertebrados. El objetivo del trabajo fue estandarizar la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial citocromo b (cyt b) para determinar la fuente de alimentación sanguínea de insectos. Inicialmente se realizó un análisis bioinformático para la búsqueda y alineamiento de secuencias del gen cyt b de los potenciales huéspedes, con secuencias que están disponible en el GenBank. Se utilizaron 10 muestras de sangre de potenciales huéspedes vertebrados (humano, perro, gallina y roedor) y para la reacción de PCR se empleó un par de cebadores universales que amplifican una región del gen cyt b, seguido de cortes con dos enzimas de restricción (RFLP) (Hae III y Mwo I), generando patrones de electroforesis específicos para los diferentes vertebrados. Se logró la estandarización de la técnica de PCR del gen cyt b que fue capaz de detectar ADN de al menos 1 μL de sangre observándose el producto de amplificación de 358 pb. El análisis de los patrones de bandas obtenidos con el corte de las enzimas mostró los tamaños de fragmentos esperados para humano, gallina, perro y roedor. Estos resultados muestran la utilidad de la técnica PCR-RFLP del gen cyt b que, con un simple par de cebadores seguido del corte con dos enzimas de restricción...
Identification of feeding sources of hematophagous insects can provide informationabout the vectorial capacity,feeding patternsin natural conditionsand indirectlyprovidedataon possible disease reservoirs preferences.Several identificationtechniquesare used,most of them based on antigen-antibody reactions.Recently molecular assayshave been developedand, some ofthese assayscandetect andidentificateonlyhuman blood. Otherassays,likethepolymerase chain reaction (PCR)basedonmitochondrialcytochromebgene,have shown high sensitivity and specificityallowingdetectionand identificationofothervertebrate species. The aim of this studywas tostandardizea PCR-RFLP basedonmitochondrialcytochrome bgene(cyt b) inorder to determineblood mealfrom insects.Initially bioinformatic analysiswasperformed forsearching andalignmentofcyt bsequencesofpotential hosts availableattheGenBankdatabase.Blood samplesfrom potentialvertebrate hostswere usedand PCR was performed using specificprimersthat amplify aregionofcyt bgene. Theproducts were digestedwithrestriction enzymes (RFLP),generating specificelectrophoresis patterns forseveral vertebrates. The PCR technique forcyt bgene wasstandardized allowing the detection of at least 1μLof blood.The 359 bp band wascorrectly amplified and the profiles obtained after the enzyme digestion withHaeIIIandMwoI were the expected for human, chicken, dog and rodents. These resultsshowed the usefulness of the PCR-RFLP ofcyt bgenethat,with a single pair of primersfollowed digestionusing two restriction enzymes,allowed the differentiationof thevertebrate species of our interestthrough the patterns obtained without sequencinghavingalso the advantage of detecting small volumesof blood sample.
Subject(s)
Cytochromes b , LeishmaniasisABSTRACT
La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria con varias formas clínicas, desde lesiones cutáneas leves hasta enfermedades fatales con comprometimiento visceral. Existen varias técnicas moleculares como por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica diferentes secuencias blanco, una de ellas es la región SLME (spliced leader miniexon), el producto se corta con enzimas de restricción (PCR-RFLP), permitiendo la identificación de las especies de Leishmania. Este trabajo fue realizado con el objetivo de caracterizar las cepas de Leishmania, empleando una PCR-RFLP de la región SLME, aisladas de humanos y caninos, provenientes de distintas zonas del país. Se analizaron 12 aislados de humanos y 40 de caninos debidamente codificados. Se empleó un par de cebadores para la región SLME, los productos amplificados fueron cortados con las enzimas Hae III y Nco I (RFLP) y los patrones de bandas analizados. Se detectó en un primer paso la presencia de parásitos del subgénero Viannia en 7 aislados de humanos y correspondientes al subgénero Leishmania en 5 aislados de humanos y 40 de caninos. La RFLP según los patrones de bandas permitió identificar a L. braziliensis en aislados de leishmaniosis tegumentaria y L. chagasi en los casos de leishmaniosis visceral. Es importante resaltar que este trabajo es el primero en el país en realizar la caracterización molecular a nivel de especies de Leishmania y los hallazgos descritos tienen una implicación a nivel epidemiológico, contribuyendo con las estrategias de vigilancia y control de la enfermedad. Adicionalmente, se sugiere el uso de otros marcadores genéticos para identificar genotipos o perfiles genéticos diferentes, entre cepas de estas especies
